在一致性評價的大背景下，國家局根據《國務院關于改革藥品醫療器械審評審批制度的意見》（國發〔2015〕44號）以及《國務院辦公廳關于開展仿制藥質量和療效一致性評價的意見》（國辦發〔2016〕8號），以及順應藥物研究開發的現實出發，參考了FDA.Guidance for industry: “Waiver of in invo bioequivalence studies forimmediate-release solid oral dosage forms based on a BiopharmaceuticsClassification System”等指南，制定了我國的人體生物等效性試驗豁免指導原則。該指導原則是基于國際公認的生物藥劑學分類系統（BiopharmaceuticsClassification System，以下簡稱BCS）起草，可用于仿制藥質量和療效一致性評價中口服固體常釋制劑申請生物等效性（Bioequivalence）豁免。BCS系統是按照藥物的水溶性和腸道滲透性對其進行分類的一個科學架構。當涉及到口服固體常釋制劑中活性藥物成分（Active Pharmaceutical Ingredient，以下簡稱API）在體內吸收速度和程度時，BCS系統主要考慮以下三個關鍵因素，即：藥物溶解性（Solubility）、腸道滲透性（Intestinal permeability）和制劑溶出度（Dissolution）。

 

 

根據BCS分類系統，藥品被分為以下四類：

 

第一類：高溶解性、高滲透性（High Solubility- HighPermeability）

第二類：低溶解性、高滲透性（Low Solubility-HighPermeability）

第三類：高溶解性、低滲透性（High Solubility-LowPermeability）

第四類：低溶解性、低滲透性（Low Solubility-LowPermeability）

 

指南指出：當口服固體常釋制劑在體內的溶出相對于胃排空時間快或非常快，并且具有很高的溶解度時，藥物的吸收速率和吸收程度就不會依賴于藥物的溶出時間或在胃腸道的通過時間。因此，在這種情況下，對于BCS分類1類和3類的藥物，只要處方中的其他輔料成分不顯著影響API的吸收，則不必證明該藥物在體內生物利用度和生物等效的可能性，即生物等效性豁免。

 

（一）對于BCS1類的藥物需要證明以下幾點：

 

1．藥物具有高溶解性；

2．藥物具有高滲透性；

3．仿制和參比制劑均為快速溶出（30min>85%），并且制劑中不含有影響主藥成分吸收速率和吸收程度的任何輔料。

 

（二）對于BCS3類的藥物需要證明以下幾點：

 

1．藥物具有高溶解性；

2．仿制和參比制劑均具有非常快速的溶出(15min>85%）)；

3．仿制制劑和參比制劑應處方完全相同，各組成用量相似。

 

藥物溶解性的測定數據相對簡單易得，且具有良好的重現性。原則中對高溶解性定義為：單次給藥的最高劑量對應的API在體積為250ml（或更少）、pH值在1.0—6.8范圍內的水溶性介質中能完全溶解。快速或非常快速溶出也可以采用溶出儀進行測定獲得。

 

然而，想要BE豁免BCS1、3類藥物，存在兩大阻礙：

 

（1）藥物滲透性；（2）輔料不影響藥物吸收速度和吸收程度，這二者均不易證明。因僅僅通過文獻報道的研究來說服審評機構是及其困難的，這也能從FDA、PMDA等監管機構對BE豁免所持的謹慎態度上可見一般。對于可能影響藥物吸收轉運的輔料包括表面活性劑、滲透壓調節劑（甘露醇、山梨醇等）、以及脂質（硬脂酸甘油酯、油酸等），如參比制劑處方包含了此類物質，監管機構對于BE豁免上至少應會要求仿制藥企業證明其用量完全一致，甚至可能還要求研究表面活性劑分子量分布或者表面活性劑溶出速率，均不易證明。

 

對于滲透性，目前FDA、EMA等審評綜述中都會披露原研企業所做的藥物BCS分類研究結果，但其可信程度需要仿制藥企業進行深入而細致地分析與核實，以免掉進“坑”中而不自知。以達沙替尼為例，在FDA公開的綜述文件Sprycel_ClinPharmR中，我們可以找到其BCS為2類，即低溶解度高滲透性。原文可在綜述中第39頁找到，如下：

 

                           

溶解度數據也在同一頁內，溶解度為pH依賴性，pH7.0時<1μg/ml，pH6時~8μg/ml，如下：

 

 

 

滲透性研究結論如下：

 

 

資料顯示采用了caco-2細胞實驗模型（一種人克隆結腸腺癌細胞，結構和功能類似于分化的小腸上皮細胞，具有微絨毛等結構，并含有與小腸刷狀緣上皮相關的酶系，可用來模擬體內腸轉運的實驗。）通過與FDA推薦的高滲透性內標藥物美托洛爾和地塞米松比較，確定達沙替尼為高滲透性藥物。如就此認為其定義為高滲透性是合理的，那我們就會掉入 “陷阱”。

 

首先，FDA審評員在上圖中指出滲透性結果應refer to section 2.2.5.5 for in vivo permeability。我們找到p26中此部分內容，其旨在研究達沙替尼是主要通過腎臟或肝臟代謝的消除途徑；通過測定放射性標記藥物，表明達沙替尼腎臟消除量非常低，而超過85%的通過糞便消除，糞便中原形藥比例為19.1%，結果如下圖：

 

 

同時給藥后2h血漿中達沙替尼M21代謝物（sulfate conjugate，磺酸復合物）水平達到總放射活性的9.5%，表明達沙替尼可能會在胃腸道經硫酸脂酶代謝。

 

 

綜上分析，達沙替尼原形藥19.1%通過糞便排泄，表明其體內絕對生物利用度應小于85%，且藥物在胃腸道存在被代謝可能。

 

FDA 2015年BE豁免指南[1]中對于高滲透性的定義為：

 

A drug substance is considered to be highly permeable when the extentof  absorption in humans is determined tobe 85 percent or more of an administered dose based on a mass balancedetermination (along with evidence showing stability of the drug in the GItract) or in comparison to an intravenous reference dose.即相對與所給藥劑量，口服吸收程度≥85%（基于質量平衡研究-同時證明藥物在胃腸道的穩定性；或與靜脈注射相比）。

 

高滲透性測定依據：

 

Thepermeability class of a drug substance can be determined in human subjects using mass balance, orabsolute BA, which are the preferred methods, or intestinal perfusionapproaches. In many cases, a single method may be sufficient: (i) when theabsolute BA is 85 percent or more, or (ii) when 85 percent or more of theadministered drug is excreted unchanged in urine, or (iii) when 85 percent ormore of the administered drug is recovered in urine as parent and metaboliteswith evidence indicating stability in the GI tract. 滲透性可通過人體受試者的質量平衡或絕對生物利用度（優先選擇）或腸道灌注研究確定；如下任一方法均可：1）絕對生物利用度≥85%；2）或≥85%藥物以原型通過尿排泄；3）或≥85%藥物以原型和代謝物形式從尿液回收-同時證明藥物在胃腸道的穩定性（胃腸道穩定的前提下尿液中代謝物為系統代謝而非胃腸道代謝后再吸收排泄）；而藥物在USP推薦的模擬胃液1h和模擬腸液中3h的降解>5%被認為不穩定。

 

因此，可以認為原研對達沙替尼體內質量平衡研究結果不支持高滲透性判斷依據：85%以上的原型藥物從尿液中排出且胃腸道穩定，更沒有絕對生物利用度>85%數據，故參考原研審評綜述資料所公布的BCS分類結論，就很可能會誤導仿制藥研究人員。

 

其次，我們如能進一步仔細閱讀，還可在p35頁發現藥物的外排蛋白（p-gp）底物研究，如下圖：

 

 

研究發現在Caco-2試驗中藥物濃度為50μM時，滲透系數A-B端為102nm/s，B-A端為222nm/s，表明達沙替尼為p-gp底物。這份研究結果中可以看到FDA對其研究提出要求：應采用一系列藥物濃度而不僅僅是單一的50μM，以及使用已經p-gp底物進行陽性對照。我們應該看到，達沙替尼分子量488，50μM 濃度換算得24.4μg/ml，該濃度已經遠遠超過藥物在pH7介質中的飽和溶解度（<1μg/ml），意味著其滲透性結果和p-gp結果都不能反應體內真實情況。這是因為在采用caco-2細胞模型研究滲透性時，藥物通常使用DMSO溶解配成高濃度溶液，再稀釋到細胞培養基中，才能獲得50μM的濃度；而人體內因為藥物溶解度低，幾乎不可能達到該濃度，其結果就會偏離實際，產生誤導的結論。藥物真實滲透性需要考慮藥物從A-B端的滲透系數與p-gp等外排蛋白對藥物的外排作用，如果高濃度的藥物可以導致p-gp飽和，則會提高其滲透性，但未飽和p-gp時的滲透性會降低。對達沙替尼而言，其為p-gp底物，且腸道飽和溶解度明顯低于50μM，所測定得到的A-B端滲透系數就可能是偏高的；這也是FDA要求研究不同藥物濃度下的滲透系數之原因。

 

藥物主要在小腸吸收，小腸不同區域的pH值不同，從偏酸性到中性直至弱堿性，也會影響到酸堿藥物的解離程度從而影響藥物吸收；因此，caco-2細胞試驗中A端（細胞頂膜）的pH也應考慮在內。研究發現，布洛芬、酮洛芬、匹羅昔康等酸性藥物在pH5.0的滲透系數顯著高于pH7.4；而美托洛爾、噻吩洛爾等堿性藥物在pH7.4的滲透性顯著高于pH5.0；而這些藥物在人體幾乎完全吸收，生物利用度>90%；因此，caco-2細胞試驗研究滲透性時，培養基的pH值應當考慮在內的。caco-2細胞實驗適合用于被動轉運的藥物；而對于具有主動轉運機制的藥物而言，caco-2細胞實驗獲得的低滲透性結論就會導致假陰性判斷。如頭孢氨芐為二肽轉運體底物，盡管其caco-2滲透性低，其體內吸收完全。同時，對難溶性藥物溶解使用的DMSO在培養基中超過1%時，就會影響caco-2細胞膜的緊密連接，使其出現假陽性結論。其他影響細胞緊密連接致密性的還包括藥物濃度、細胞培養條件等，不同實驗室之間的結果往往難以重現。

 

 

總之，仿制藥開發過程中，監管機構對于BE豁免的審批還是很謹慎的。熟悉FDA仿制藥申報的專家曾透露，在美國要證明一個藥物的高滲透性所需的工作量和費用也不亞于一個BE，故美國很少普通口服制劑的仿制藥真正通過BE豁免上市。我國的普通固體口服制劑如希望BE豁免，要說服CFDA也同樣不易。