1細胞培養基的生產和過程控制
 

細胞培養基作為生物制品生產的重要原材料之一，其質量對生物制品有重要的影響。細胞培養基的生產工藝和細胞培養基的原材料選用、生產過程及檢驗過程中的質量控制對于細胞培養基的產品質量具有直接影響。其中原材料的成份及其質量直接決定了細胞培養基產品的質量及安全性，選擇合適的物料是實現細胞培養基功能過程中需要解決的基礎問題。生產工藝的選擇（如原料的研碎、混合技術等）及生產過程中的質量控制等直接影響產品的溶解性、批生產量及批次間差異，進而影響產品的質量。
 

cGMP稽查員在對國內細胞培養基生產企業進行cGMP審計時指出，細胞培養基的生產工藝及設備應經過驗證，原材料必須做鑒別試驗，記錄應真實反映生產過程的實際情況，生產過程偏差處理應包括對出現偏差之前涉及到的批次均應進行調查等等。這些要求是基于FDA對生物制藥用原料的質量要求方面提出，遠遠高于國內對藥用原料的要求。隨著對人用和動物保健用生物制品安全性要求的提高，嚴格執行GMP規范進行細胞培養基生產是國內細胞培養基行業發展的必然趨勢。

 

1.1細胞培養基的原料選擇及質量控制
 

1.1.1原材料的選擇

由于動物細胞培養基產品屬于藥用原料，《哺乳類動物細胞培養基行業標準》對細胞培養基產品的微生物限度、內毒素含量進行了限定，所以細胞培養基所用原料宜采用注射級、藥用級原料。對于部份沒有注射級和藥用級的原料，細胞培養基制造者針對自身產品質量要求，制定一些重要指標（微生物限度、內毒素、重金屬等）進行原材料的質量控制。
 

1.1.2原材料的質量控制

細胞培養基生產企業建立完善的原材料質量標準，對于原材料的來源、檢驗、使用、及銷毀等有明確的可追溯記錄。在質量控制過程中，藥用級原材料的質量標準應參考中國藥典相關標準，對于非藥用級原材料應根據生產工藝需要與供應商一起共同確定質量標準，質量標準應包括如下內容：

¨      指定的物料名稱和企業內部使用的物料代碼

¨      藥典專論的名稱（如有）

¨      經批準的供應商以及原始生產商

¨      印刷包裝材料的樣張

¨      物料質量標準依據及其編號

¨      取樣、檢驗方法或相關規程編號

¨      定性和定量的限度要求

¨      貯存條件和注意事項

¨      復驗前的最長貯存期
 

原材料的質量檢測主要從材料、人員、方法三個方面進行控制：

1)    具有必要的檢測試劑、設備和設施，如鱟試劑、分析天平、潔凈操作室或取樣柜。

2)    擁有相應操作資質和能力的檢驗人員，如相應檢測人員應具備化驗員資質并經過全面的技能培訓。

 選擇具有法律效力的檢測方法以及對應的操作規范，在檢測方法的選擇方面藥用原料應優先采用藥典方法，非藥用原料應采用經過驗證有效的檢測方法，在確定檢測方法后應制定相應標準操作文件，用于規范試驗操作。
 

應嚴格控制細胞培養基的原材料質量管理，并建立相應完善的原材料質量管理文件體系。原材料的質量管理方面，應明確規定責任范圍和流程方法，它們是保證原材料質量的基礎。原材料質量管理文件體系內容通常包括兩個方面，一方面是明確原材料質量責任應歸屬的部門及人員，以實現分工明確；另一方面是明確原材料的取樣、檢驗、放行、判定不合格、異常情況、偏差、驗證等事務具體流程，確保流程正確，方法無誤，為質量控制提供依據。

 

1.2細胞培養基生產工藝

 

       傳統的細胞培養基生產工藝即生產過程通常分為物料配比、物料干燥、物料研碎、物料混合、物料包裝、成品的檢驗等6個階段，下面結合過程中的質量控制對此工藝進行介紹：

 

1.2.1物料配比

 

      物料配比是根據配方要求將各種原料按比例配制的過程。配制需嚴格執行配方，才能保證細胞培養基產品功能的實現及降低批間差，而實現低誤差的物料配比過程需從以下幾個方面進行控制：

 

1)   提供與生產工藝規程匹配且經過審核的、有效力的物料配方，生產部門根據配方制定配比操作記錄，經質量管理部門審核后，方可投入生產作業使用；

 

2)   具有詳細明確的經過驗證的設備、設施、工序操作規程以及相關管理規程，如通過編制設備、設施的驗證、使用、維護、維修操作規程來明確操作方法和流程，通過編制相應管理文件，來明確人員責任；

 

3)   具有足夠的在校驗有效期內的精確度合理的計量器具，及與產品質量要求相匹配的生產環境設施，如為降低細胞培養基微生物、內毒素限度使用潔凈廠房進行生產等；

 

4)   足夠的經過合理培訓具有上崗資質的操作人員和設備管理人員（操作員上崗證、計量員證），各崗位操作人員配備足夠，能夠確保操作過程實現雙人操作雙人復核；

 

5)   配備足夠的基層管理人員以及現場QA，起到指導和監督作用。

 

1.2.2物料干燥

 

       基于細胞培養基產品營養豐富，且不是無菌制劑的特性，為避免微生物滋生破壞細胞培養基成份，需控制細胞培養基中的水分含量，依據行業標準要求，其干燥減重質量分數應低于5.0%，而原料干燥是控制其含水量的最重要環節。

 

       目前常用的干燥方法有常壓干燥和冷凍干燥。常壓干燥包括烘干干燥、鼓式干燥、帶式干燥，由于國內細胞培養基生產廠家普遍采用球磨缸進行生產，由于各缸獨立，無法使用鼓式干燥、帶式干燥的方式進行連續烘干作業，所以普遍采用烘干干燥的方式按批進行物料干燥。冷凍干燥主要用于不能耐受高溫的貴細物料的干燥處理。

 

1.2.3物料研磨

 

       細胞培養基顆粒越細，同質條件下比表面積越大，其溶解性越好，而其成品細度是由物料的研磨過程直接決定。對于物料的研磨，傳統普遍采用藥用球磨機，其主要優點是結構簡單、操作方便、易于清潔及使物料混合作用（能夠實現缸體內各種成份的均勻分布）。球磨缸內的研磨球材質通常有陶瓷、瑪瑙、不銹鋼（304或316L）。但是球磨機也存在批量小、噪音大、難以控制溫度、粉狀物料不易取出且取料過程會產生大量粉塵等缺點。目前國內一些細胞培養基生產企業在球磨缸取料工序裝備了全密閉自動取粉裝置，較好的解決了粉塵污染問題，也進一步降低了由于物料的裸露可能帶來的引入異物及物料受潮的風險。

 

1.2.4物料混合

 

       混合設備首先必須具備能夠實現物料均勻性的功能。在上述物料研磨過程中，可能存在投料微量誤差、過程參數細微差異以及其他不可控因素，上述因素的累積會導致不同研磨單元內物料可能出現一定的差異（外觀、理化性質、培養性能），這些差異將直接影響產品的使用，造成使用者生產效率及產品的批間差異。根據哺乳類細胞培養基行業標準中對于“批”的定義，即同一臺混合設備一次混合量所生產的均質產品為一批，物料經研磨單元研磨以后必須進行總混和均勻后才能稱為一批成品進行包裝。目前常用的物料混合設備以摻和機、雙錐混合機較為常見。

 

1.2.5物料包裝

 

       物料的包裝分為內包裝和外包裝，主要為了實現如下功能：

 

1)   阻隔性功能：即密閉保存（避光、防潮、防污染、防氧化等），是指直接與產品接觸的內包裝，在選擇內包裝材料時其阻隔性是關鍵，高阻隔性包裝薄膜所采用的阻隔性樹脂主要有EVOH、PA、PET、PVDC、PC、MXD6和聚丙烯腈共聚物，其中PVDC是開發較早的阻隔性能優異的材料，而包裝用薄膜材料結構包括：紙／塑料、塑料／鍍鋁塑料、紙／鋁箔／塑料和塑料／鋁箔／塑料等幾種【11】；

 

2)   產品信息的提供：產品外包裝上應明確標識品名、批號、代碼、生產日期、有效期、使用方法等基礎信息，并隨附企業質量監管部門下發的產品合格證以及質量檢驗報告等質量證明文件；

 

3)   易于運輸的防護：確保外包裝物能夠抵御運輸過程中裝卸產生撞擊的沖擊，并要具備一定的堆疊強度，對于需要遠途運輸的不能耐受高溫的成品應做好低溫保護工作（填充保溫材料，包裝箱內混裝冰袋、干冰等蓄冷物）。

 

1.2.6成品的檢驗

 

細胞培養基產品生產完畢后，由質量檢測部門對該批次產品進行檢測，在這一周期內，成品處于待驗狀態，儲存條件應與合格成品一致，應專區存放專人管理，避免混淆和遺漏，在收到質量檢測部門檢測合格予以放行的通知后，轉交成品庫，移入合格品區備售。

 

1.2.7細胞培養基生產的新工藝

 

采用上述傳統的生產工藝（通常稱作球磨工藝）生產的產品均一性較好，物化性能穩定以及細胞培養效果較好，但是存在批量小、研磨過程中的散熱難以控制、噪音及粉塵污染較大等缺點。2005年新開發了一種連續生產的針式研磨系統（pin mill），集“物料混合－針式研磨－研磨后混合”一體，用于工業化生產干粉細胞培養基，可以用來生產從10kg至4000kg不等批量的干粉細胞培養基。

 

Pin mill研磨系統是一種高速沖擊研磨系統，包括一個進料口、兩個同軸帶有研磨針的轉盤以及一個出料口。當原料通過進料口投入研磨器后到達轉盤中央，在轉盤旋轉離心力的推動下往徑向外側運動同時被相互咬合且相對旋轉運動的研磨針研細。物料在進入針式研磨腔前和完成研磨離開研磨設備后都使用混合機進行了混合，以確保進入研磨器和最終產品的成份均勻性，其生產工藝流程見下圖1-1。


 

圖1-1 pin mill生產干粉細胞培養基工藝流程圖

 

與傳統的球磨生產工藝相比，pin mill 生產系統研磨的顆粒更細，批次控制范圍大且靈活（0.5~4000kg），在研磨及研磨后顆粒輸送的過程中，采用氮氣控制機體的溫度，使研磨機的溫度保持在40℃以下，并且避免了粉塵污染、交叉污染等。該系統機體的拆分、組裝及清潔也較為簡單，適合cGMP生產。

 

關于使用pin mill 系統生產的DPM性能，如生產過程中的成份組成均質性、生產的產品性能及是否適合細胞培養和生物制品生產等，有詳細的驗證研究，結果顯示，pin mill生產工藝生產的產品均勻分布性滿足標準，并且均勻性與成份以及批量大小無關；生產的產品諸如溶解性、pH、滲透壓等理化性質、細胞培養方面及生物制品生產與球磨生產工藝相同。